이 시험은 특정아미노산 합성이 저해된 미생물인 살모넬라(Salmonella typhimurium) 또는 대장균(Escherichia coli)을 이용한 유전자 돌연변이시험으로 살모넬라균은 증식에 histidine을 필요로 하는 변이(His- -> His+)을 지표로 하고, 대장균은 증식에 tryptophan을 필요로 하는 변이(Try- -> Try+)를 지표로 점돌연변이를 야기하는 화학물질의 유전독성을 평가하기 위한 시험으로, 시험에 사용되는 균주는 DNA 손상에 대한 수복기능이 상실되어 있고 각종 유전독성 유발물질 및 자외선에 대해 높은 감수성을 나타냅니다.

시험물질에 의한 DNA 염기쌍의 치환, 삽입, 결실과 관련된 점돌연변이(C-G 염기쌍 또는 A-T 염기쌍)를 찾기 위해 수행되며, 필수아미노산을 합성하는 데 필요한 유전자 기능이 손실된 균주에 시험물질에 의한 기능 회복을 평가합니다.

복귀돌연변이 집락 계수는 육안으로 확인하며, 집락수에 대한 실측값과 평균값 및 표준편차로 표시하여 결과값을 도출한 후 복귀돌연변이 여부를 판단합니다.

- 모든 시험 균주에 대해 대사활성계(S9 mix)적용 및 미적용 계열을 적용하며, 음성대조군, 시험물질 처리군, 양성대조군을 설정합니다.
- 최초 용량결정시험을 통해 본시험 용량을 설정하고, 본시험을 수행하여 시험 결과에 대한 재현성 및 유전독성을 확인합니다.

일반적으로 사용하는 포유동물 CHL(Chinese Hamster Lung) or CHO(Chinese Hamster Ovary)배양 세포 내에 염색체의 구조적 이상을 유발하는 물질을 확인하는 시험으로 염색체의 형태를 관찰하여 구조적인 이상 여부와 배수성이 증가하는 수적 이상에 유무를 판별하여 유전독성을 평가하는 시험입니다.

체외 염색체이상시험은 확립된 세포주의 배양 또는 인간 또는 설치류 기원의 1차 세포 배양을 사용할 수 있다. 사용되는 세포는 배양에서의 성장 능력, 핵형의 안정성(염색체 번호 포함) 및 염색체 이상의 자발적 빈도를 기준으로 선택해야 합니다.

염색체의 구조적 이상은 염색체 또는 염색분체의 두 가지 유형으로 분류됩니다. 염색체이상 유무에 대한 분석은 중기 세포를 사용하여 수행하므로, 중기 억제 물질(예: Colcemid® 또는 colchicine)을 처리하여 세포수거, 염색 및 슬라이드 도말의 과정을 거친 후 중기 세포를 현미경으로 관찰하여 염색체이상 유무를 분석합니다.

인공적인 양성 결과를 초래할 수 있는 조건, 즉 시험 화학물질과 염색체 사이의 직접적인 상호작용에 의해 야기되지 않은 염색체 손상을 피하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 이러한 조건에는 pH 또는 삼투압 농도의 변화, 배지 성분과의 상호 작용 또는 과도한 수준의 세포 독성이 포함됩니다.

- 단 시간 대사활성계 처리군 (6시간 처리 18시간 증식), 단시간 대사활성계 비처리군 (6시간 처리 18시간 증식) 및 대사활성계 비처리 연속 처리군 (24시간 처리)을 구성으로 3계열로 설정하며 음성대조군, 시험물질 처리군, 양성대조군을 설정합니다.
- 용량결정시험을 통해 본시험에 용량을 결정하고 검경할 검체가 제작되는 본시험을 수행합니다.
- 제작된 검체에 중기상세포를 현미경으로 검경하여 유전독성 여부를 판정합니다.

골수 또는 말초혈액세포에서 체혈되는 적혈구의 분석을 통해 시험물질에 의해 유발되는 적아세포의 염색체 혹은 유사 분열기관에 대한 손상을 검출하는 시험법으로 염색체에 구조적이상 등으로 인한 방추사가 부착되지 않아 양극으로 이동하지 못한 핵은 탈핵되지 않고 세포 내에 남게 되는데 이를 판별하여 유전독성을 평가하는 시험입니다.

설치류 골수 세포 중 다염성적혈구에 출현하는 소핵을 지표로 하여 시험물질의 염색체 이상 유발을 체내(in vivo)에서 평가하는 것입니다. 염색체의 형태변화(구조이상)에는 다양한 종류가 있으나, 최초로 염색체절단이 일어나고 이것이 수복되는 과정에서 다른 절단면과 재결합하면 교환형의 이상이 나타난다. 절단이 수복되지 않으면 동원체를 갖지 않는 염색체 단편이 형성되고, 이 단편이 세포 분열 시에 잔존하여 소핵을 형성합니다.
따라서 소핵은 염색체의 구조이상을 반영하고 있는 것입니다. 또한 세포 분열기전의 장애가 원인이 되어 염색체가 세포 분열 시에 잔존하게 되어도 소핵화 한다는 점에서 염색체의 수적 이상까지도 검출할 수 있다.
결론적으로 본 시험법은 골수 중의 분열 중기 상을 해석하는 염색체이상시험과 함께 생체 내에서 염색체이상 유발물질을 검출하는 시험법으로 받아들일 수 있습니다.

- 음성대조군, 시험물질 처리군 및 양성대조군으로 설정하여 시험하며, 임상적용 예정 경로를 참고하여 투여를 실시하며, 일반적으로 경구투여합니다. 투여는 24시간 간격으로 2회 연속 투여합니다.
- 용량결정시험을 통해 최대내성용량(MTD, Maximum tolerance dose)를 고려하여 본시험에 용량을 결정하고 검경할 검체가 제작되는 본시험을 수행합니다.
- 제작된 검체를 현미경으로 검경하여 MN(Micronucleus)의 수를 계수하여 유전독성 여부를 판정합니다.

이 시험은 시험물질을 투여한 설치류 등의 동물로부터 분리한 세포 또는 핵에 함유된 DNA의 절단 여부를 평가함으로써 시험물질에 의한 DNA 손상을 규명하는 데 목적이 있습니다.

코멧시험의 목적은 DNA 손상을 일으키는 물질을 확인하는 것입니다. 알칼리조건 하(> pH 13)에서의 코멧시험은 DNA 단일가닥의 절단이나 이중가닥의 절단을 확인할 수 있습니다.
코멧시험에서 확인되는 DNA 가닥의 절단은 시험물질이 DNA와 직접 상호작용하여 절단된 경우나, 알칼리에 의해 손상되는 불안정 부위이거나, 또는 DNA 복구과정에서 발생하는 일과성 절단 등입니다.
이러한 DNA가닥의 절단은 복구됨으로써 그 영향이 남아 있지 않을 가능성도 있고, 세포를 치사시킬 가능성 또는 돌연변이로 고정되어 생체에 영구적 변화를 초래할 가능성이 있습니다.
또한, 암을 포함하여 사람의 다양한 질병 관련 염색체의 손상을 일으킬 수도 있습니다.

실험동물은 일반적으로 랫드를 사용하며, 6 - 10 주령 건강한 젊은 성체의 설치류를 사용합니다.

- 음성대조군, 시험물질 처리군 및 양성대조군으로 설정하여 시험하며, 임상적용 예정 경로를 참고하여 투여를 실시하며, 일반적으로 경구투여합니다. 투여는 24시간 간격으로 2회 연속 투여합니다.
- 용량결정시험을 통해 최대내성용량(MTD, Maximum tolerance dose)를 고려하여 본시험에 용량을 결정하고 검경할 검체가 제작되는 본시험을 수행합니다.
- 측정 준비가 완료된 검체를 SYBR gold 및 Green 등으로 염색하여 epi-fluorescence장치와 디지털 카메라를 갖춘 현미경을 사용하여 적절한 배율(200x)로 측정합니다.
- 염색은 SYBR Green을 1x TE buffe를 이용해 10000배희석 하여 well 당 100µL씩 처리하여 10분간 염색을 실시합니다.
- 각 표본에 대해 최소한 150개 세포를 분석하며, hedgehog를 별도로 개수합니다.

일반적으로 암/수 랫드를 사용하며 투여기간은 반복독성시험 결과에 따라 수컷은 28일 또는 63일이며, 암컷은 2주 또는 약 3주입니다.
주요 평가항목은 생식세포의 성숙, 교미행동, 수정, 배자의 착상 전 단계, 착상 등입니다.

2 종 이상의 동물을 사용하며, 설치류로는 랫드, 비설치류로는 토끼를 사용합니다.
시험물질을 임신동물의 기관형성기(착상부터 경구개 폐쇄기) 동안 투여한 후 태자의 기형, 치사, 발육지연 등의 발생여부를 관찰합니다.
주요 평가항목은 비임신 암컷과 비교 시 독성의 증가여부, 배/태자의 사망률, 발육상태 및 형태학적 변화(골격검사/내부장기검사)입니다.

일반적으로 랫드 또는 마우스를 사용하며, 시험물질을 임신 6일부터 포육 20일(이유기)까지 투여한 후 차세대 동물의 성장, 행동기능 및 생식기능 발달에 미치는 영향을 관찰합니다.
이 기간동안 유발된 영향은 잠복기가 길 수 있기 때문에 차산자의 성적 성숙기까지 지속적으로 관찰합니다.
주요 평가항목은 비임산 암컷과 비교 시 독성의 증가여부, 출생 전/후의 배자/태자/차산장의 사망, 성장 및 발달의 변화, 행동, 성적 성숙 및 차산자 생식기능 등입니다.

설치류에서 수태능 및 초기배 발생시험과 출생 전/후 발생 및 모체기능시험의 투여기간을 하나로 통합하여 생식/발생 과정의 전반적인 독성을 평가하는 시험법입니다.
이 시험법에서 태자검사를 포함시켜 수행하였으며, 충분히 높은 용량에서도 명백한 음성으로 판단되었다면 더 이상의 생식/발생독성시험은 수행하지 않아도 됩니다.
단, 비설치류에서의 배/태자 발생시험은 요구됩니다.

설치류에서 가장 단순한 조합시험법은 수태능 및 초기배 발생시험과 태자검사를 포함한 출생 전/후 발생 및 모체기능시험으로 구성됩니다.
태자검사를 포함한 출생 전/후 발생 및 모체기능시험에 있어서 사람의 노출량을 초과한 고용량에 있어서도 출생전 영향이 없는 경우에는 추가로 배/태자 발생시험을 시행하여도 사람에 대한 위해성을 평가하는데 큰 차이를 나타내지 않습니다.

다른 조합시험으로는 수태능 및 초기배 발생시험에서 암컷 동물에 대한 투여를 경구개의 폐쇄까지 계속하고, 배/태자 발생시험에 따라 태자를 검사하여 출생 전/발생 및 모체 기능시험을 조합하면, 표준시험법에서 요구하는 모든 검사가 실시됩니다.
두 가지 조합시험 모두 비설치류 배/태자 발생시험은 별도로 수행해야 합니다.

일반적으로 랫드를 사용하며, 시험물질을 교배 2 주전부터 투여하여 수컷은 4 주 이상, 암컷은 차산자 출생 후 13 일까지 투여하면서, 생식관련 독성의 발생 여부를 스크리닝하는 시험입니다.

2 종 이상의 동물을 사용하며, 설치류로는 랫드, 비설치류로는 토끼를 사용합니다.
시험물질을 임신동물의 기관형성기(착상부터 제왕절개 전) 동안 투여한 후 태자의 기형, 치사, 발육지연 등의 발생여부를 관찰합니다.
주요 평가항목은 비임신 암컷과 비교 시 독성의 증가여부, 배/태자의 사망률, 발육상태 및 형태학적 변화(골격검사/내부장기검사)입니다.

중추신경계 : 운동량, 행동변화, 협조성, 감각/운동 반사 반응 및 체온 등의 검사로 구성되며, 랫드 또는 마우스를 사용합니다.

기능관찰시험(Functional observation battery, FOB)

어윈 변형시험(Modified Irwin's)

호흡기계 : 호흡률과 호흡기능의 척도로서 일회호흡량(tidal volume) 또는 헤모글로빈의 산소포화도를 검사하며 랫드 또는 마우스를 사용합니다.

Whole body plethysmography 시험

심혈관계 : 심전도, 혈압, 심박수를 검사합니다. 재분극과 전도 이상에 대한 검사를 포함하는 in vitro 및 in vivo 시험 등이 사용되며, 세포와 개를 주로 사용합니다.

시험계는 HEK-293 cell 또는 CHO cell에 특정 유전자를 일시적 또는 영구적으로 삽입하여 사용하며, Whole-cell voltage clamp 를 이용하여 세포막을 통한 미세전류를 기록합니다.
3 개 농도 이상에 대한 시험이 권장되며 50% 전류 억제 농도(IC50)를 확인하기 위하여 20%에서 80%까지의 억제 범위에서 수행합니다.

hERG assay : Potassium channel, hERG gene

Nav1.5 assay : Sodium channel, SCN5A gene

Cav1.2 assay: Sodium channel, CACNA1C/CACNB2/CACNA2D gene

Telemetry system
실험동물을 마취하지 않고, 구속하지 않은 상태에서 혈압과 심전도를 측정하는 시험으로 혈압과 심전도의 신호를 무선으로 송출할 수 있는 장치(Transmitter)를 실험동물의 체내에 삽입하여 실험합니다.
시험계는 주로 개(Beagle dog)을 사용합니다.
데이터의 측정시점은 시험물질의 동태학적 시험자료를 근거로 설정하며, 시험자료가 제공되지 않는 경우에는 일반적인 시험물질의 혈중 농도 추이를 참고하여 결정할 수 있습니다.
일반적으로 단회투여하며, 시험물질의 특성에 따라 반복투여 할 수 있습니다.

주요평가지표
- 혈압 : 수축기 혈압, 이완기 혈압, 평균 혈압, 심박수
- 심전도 : PR interval, QRS duration/interval, QT interval, QTc interval, RR interval, ECG waveform

중추신경계 : 일반운동활성 검사, 불안검사, 행동약리, 학습 및 기억, 시각, 청각, 통증, 경련유발, 바비탈 수면 검사 등을 통해 중추신경계에 미치는 약물의 영향을 세밀하게 관찰합니다. 필요시 2 차 추적시험을 통하여 행동이상의 원인을 규명할 수 있습니다.

심혈관계 : 심장과 관련하여 적출심장시험, 세포독성시험, in vivo 심근경색 시험, 심근세포 사멸유도시험, 조직학적 앰색 방법 등이 있으며, 혈관과 관련하여 적출 혈관의 수축 능력 관찰, QT 연장과 관련하여 ADP assay, MEA array, 마취동물 ECG 측정, AV block 모델 시험, 혈액/뇨/전해질 검사 등이 있습니다.

호흡기계  : 혈액 내 가스 및 산소포화도 분석, 기도저항 측정, 폐 단성 측정 등이 있습니다.

뇨배설기계 : 일반독성시험에서 신장기능이상 의심 소견이 관찰된 경우, 사구체 여과율검사, 혈장 유량검사, 뇨 내의 생체마커 검사를 통해 사구체손상, 세뇨관 손상 등을 구분합니다.

자율신경계 : 자율신경계 관련 부작용 및 독성이 관찰된 경우, 수용체 결합시험, agonist/antagonist에 대한 기능적 반응시험, 직접자극 및 심혈반응 측정, 압반사 시험, 심박동 변이 측정 등을 통하여 부작용 및 독성의 자율신경계 관련성을 규명합니다.

소화기계 : 일반독성시험에서 위장관 관련 부작용 및 독성이 관찰된 경우, 위액분비평가, 위궤양평가, 위배출시간 평가 등을 통하여 위에 대한 영향을 평가하며, 위장관 수송능 평가, 장관궤양평가를 통하여 하부 위장관에 대한 영향을 평가합니다.

시험물질이 국소 부위(피부)에 노출되었을 때 나타나는 피부자극을 평가하는 시험으로서 Draize시험법을 기본으로 합니다.
실험동물은 토끼가 사용되며, 시험물질을 노출 시킨 후 72 시간까지 관찰하면서 염증반응에 의해 나타나는 홍반, 가피 및 부종을 관찰하여 자극성을 평가합니다.
6 마리를 사용하여 찰과구역과 비찰과구역을 구분하여 실험합니다. 평가결과는 1차 피부자극지수를 기준으로 비 자극성에서 강한 자극성까지의 4 단계로 구분합니다.

시험물질이 국소 부위(안점막)에 노출되었을 때 나타나는 안점막자극을 평가하는 시험으로서 Draize시험법을 기본으로 합니다.
실험동물은 토끼가 사용되며, 시험물질을 노출 시킨 후 7 일까지 관찰하면서 각막, 홍책 및 결막의 손상 정도를 관찰하여 자극성을 평가합니다.
9 마리를 사용하며 세척군과 비세척군으로 구분하여 실험합니다. 평가 결과는 무자극물에서 강 자극물까지 10 단계로 구분합니다.

국소림프절시험, Local Lymph Node Assay(LLNA) : BrdU-ELISA

기니픽을 이용한 Maximization test(GPMT)

기니픽을 이용한 Buehler test

아낙필라시스 쇼크 반응시험

이종 수동 피부 아낙필락시스 반응시험/p>

본 시험법은 인체피부 상층부인 표피(epidermis)의 생화학적 및 생리학적 특성을 매우 유사하게 모방한 인체피부모델을 이용하여 UN GHS 기준에 따라 피부자극 물질을 구별하는 생체외(In vitro) 피부자극 시험법입니다.
본 시험법은 생체내(in vivo) 피부자극 시 발생하는 작용기전의 초기 단계인 세포 및 조직 손상을 직접적으로 다룹니다.
시험물질을 인체피부모델에 국소적으로 적용하여 일정 시간 노출시킨 후 세포 생존율을 측정하여 시험물질의 피부자극을 평가합니다.
상용화된 인체피부모델(EpiSkin™, EpiDerm™, SkinEthic™ RHE, LabCyte EPI-MODEL24, epiCS® , Skin+® , KeraSkinTM)을 사용합니다.

피부자극물질은 각질층을 투과하여 피부세포의 기초가 되는 부분을 손상시킬 수 있으며, 손상된 세포는 진피층의 세포, 특히 혈관의 기질 세포와 내피세포에 염증 반응을 일으킵니다.
이로 인한 내피세포의 확장과 투과성의 증가는 홍반과 부종을 유발하며 이는 피부자극의 주요 특징으로 나타납니다.
본 시험법은 이러한 원리를 바탕으로 시험물질에 의한 세포 및 조직 손상 정도를 측정하여 피부자극물질을 구별할 수 있습니다.
인체유래 각질세포로 구성된 인체피부모델에 시험물질을 국소적으로 적용한 후 세포 생존율을 측정하여 시험물질의 피부자극성을 평가합니다.

인체각막유사 상피모델을 이용한 안자극시험법은 모델에 시험물질을 노출시켜 얻어진 생존율을 근거로 하여 안자극 또는 심한 안손상으로 분류되지 않는 물질을 식별하는데 사용되는 생체외 안자극 시험방법입니다.
사용 모델의 시험법에 따라 전처리 시험물질 처리 세척 침지 후배양을 거쳐 분석법 또는 분석법을 이용하여 음성대조군 대비 시험물질 처리군의 상대적인 조직 생존율을 측정하여 안자극성을 평가합니다.
시험결과 판정은 음성대조군 대비 시험물질 처리군의 상대적인 조직 생존율이 각 모델의 시험법에서 제시된 기준치를 초과하면 안자극 또는 심한 안손상으로 분류되지 않는 물질로 판정합니다.

시험물질에 의해 생체내에서 주로 발생되는 심한 안손상, 안자극, 각막혼탁, 홍채염, 결막, 충혈 및 결막부종은 시험물질의 각막 및 또는 결막을 통한 침투와 세포 손상으로 시작되는 일련의 반응들의 결과입니다.
그러나 조직 손상의 원인이 되는 물리화학적 과정들과는 상관없이 세포독성은 화학물질에 의한 전반적인 심한 안손상/안자극 반응을 결정짓는데 기전적으로 중요한 역할을 합니다.
심한 안손상이나 안자극으로 분류가 필요치 않는 물질을 구별하기 위해서 모델에 시험물질을 국소적으로 노출시킨 후 생존율을 측정하는 것은 심한 안손상 또는 안자극을 일으키는 모든 물질이 각막 상피세포 및 결막에서 세포독성을 유도한다는 가정에 근거한 것입니다.

본 시험법은 인체피부의 상부인 표피의 조직학적, 형태학적, 생화학적 및 생리학적 특성과 매우 유사하게 3차원으로 재구성한 인체피부모델을 사용하여 비가역적인 피부손상인 피부부식을 평가하는 생체외(in vitro) 피부부식 시험법입니다. 본 시험법은 인체피부모델에 시험물질을 국소적으로 적용하여 일정 시간 노출시킨 뒤 세포생존율을 측정하여 피부부식성을 평가하는 시험법으로 세포생존율을 측정하여 부식성 및 비부식성과 혼합물의 하위 범주를 분류할 수 있습니다.

시험물질은 비형질전환 인체유래표피 각질세포로 구성된 3차원 인체피부모델에 국소적으로 적용됩니다.
모델은 조직화된 기저층(basal layers), 가시층(spinous layers), 과립층(granular layers) 및 및 체내에 분포하는 지방 중 주요 지질층(lipid class)인 세포간 판상형 지질층(lamellar lipid layer) 을 포함하는 다층의 각질층으로 구성됩니다. 시험법은 부식성 물질에 의해 각질층을 투과하여 세포독성을 나타낸다는 원리를 기반으로 합니다.

이 시험은 독성발현경로(AOP, Adverse Outcome Pathway) 중 네 번째 핵심 단계(Key event)인 T-세포의 활성화와 증식을 평가하는 방법입니다.
시험물질 적용 부위와 가까운 림프절 내에서 림프구의 증식 수준을 나타내는 5-Bromo-2-deoxyuridine(BrdU) 양을 ELISA 방법을 이용해 정량적으로 측정하여 피부감작성(과민성)물질과 비감작성(과민성)물질을 구분하는데 목적이 있습니다.

LLNA : BrdU-ELISA 시험법은 특정 제한점을 가지면서 잠재적인 피부감작성(과민성) 시험물질을 식별하기 위한 변형된 비방사성 LLNA 시험법(A modified non-radioactive LLNA method)으로 기니픽 시험(TG 406) 대비 사용되는 동물의 수를 감소시킬 수 있으며, 면역보조제(Adjuvant) 사용이 불필요하여 동물의 고통을 줄일 수 있습니다.
또한, LLNA(TG 429)와 달리 방사성 동위원소를 사용하지 않고 피부감작성(과민성)을 확인할 수 있기 때문에 작업 시 방사성 노출이나 방사성 폐기물 처리 문제가 없다는 장점이 있습니다.

실험동물은 일반적으로 CBA/J 계통의 마우스를 사용하며, 예비시험을 수행하여 전신독성이나 과도한 국소 피부 자극을 나타내지 않는 농도를 설정한 후 본시험을 수행합니다.
본시험 수행 시 마우스는 군당 최소 4마리를 사용하고, 매 시험마다 최소 3개 농도의 시험물질군, 부형제대조군 및 양성대조군을 포함합니다. BrdU 용액을 투여한 후 약 24시간이 경과하면 실험동물을 안락사 시켜 시험물질을 도포한 부위의 이개 림프절을 적출하고 인산완충용액(PBS)을 이용하여 세포부유액을 만드는데, 이때 음성대조군 세포부유액의 흡광도 값이 0.1 ∼ 0.2 이내가 되도록 세포부유액 총량을 조정합니다.
그 후 세포부유액을 anti-BrdU 항체와 반응시키고 마이크로 플레이트리더를 이용하여 370nm와 492nm(reference 파장)에서 흡광도를 측정합니다. 시험결과는 부형제대조군의 평균 증식에 대한 시험물질군의 평균 증식의 비율인 감작지수(Stimulation Index, SI)로 나타내며, 시험물질을 피부감작성(과민성)물질로 판정하기 위해서는 SI 지수가 1.6 이상(SI ≥ 1.6)이어야 합니다..

같은 원리의 시험으로는 유세포 분석을 이용한 피부감작성(과민성)시험(국소림프절시험, LLNA: BrdU-FCM)이 있습니다.